《逆转录 PCR实验指南》评介

——（ RT-PCR Protocols ）

作 者：Joe O'Connell,博士 爱尔兰国立大学医学系

出 版： Humana出版

索书号： Q591.8/R893/2002/Y

藏书点： 武大外教中心

逆转录 PCR已经成为生物医学领域最广泛使用的技术之一。它能够方便地检测并定量特定基因的表达，如疾病导致基因表达变化能被灵敏地检测出来，从而使它在分子水平探讨致病机理中大有用武之地。逆转录PCR在诊断中还有很多用途：例如高灵敏度地检测人免疫缺陷病毒（HIV）和丙型肝炎病毒(HCV)之类的RNA病毒。此外，逆转录PCR是生物医学研究中许多关键技术的必须组分，例如原位检测mRNA、抗体工程和cDNA克隆。由爱尔兰国立大学医学系教授Joe O'Connell主编的《逆转录PCR实验指南》，《分子生物学方法》的第193卷，详尽的介绍了这一技术，并展示了它与其它技术相结合所带来的巨大优越性。

本书介绍了逆转录 PCR技术的优化和应用，书中每个章节都包含详细的实验方案，即使是一个完全不懂逆转录PCR的人也能运用自如。值得强调的是，该书展示了逆转录PCR如何与其他技术相互结合，互为补充，比如显微解剖激光捕获（laser-capture microdissection,LCM）,实时PCR（real-time PCR），基因芯片分析(microarray analysis)，高效液相色谱（high-pressure liquid chromatography,HPLC）以及实时荧光分辨技术(time-resolved fluorometry)。运用逆转录PCR分析mRNA的最大优点在于它极高的灵敏度，采用嵌套式逆转录PCR基本上能够检测到单个mRNA拷贝。如果配合激光捕获技术，对固体组织中少量细胞的mRNA进行分析将易如反掌，因此它得到了多方面的应用；如在对发育生物学中胚胎发育初期的几个细胞的研究，脑科学研究低丰度mRNA的分析中，它都起着不可或缺的作用。

随着 RT-PCR技术的发展，我们不仅能定性的研究特定基因的表达，还可以对其进行定量，本书第六章介绍了这一方法。许多定量逆转录PCR方法是基于竞争性PCR,即构建一个含有与目标核甘酸有相同引物位点，但大小不同的内参PCR模板，该模板能与目标核甘酸竞争引物；在PCR反应体系中加入不同剂量的内参模板，当加入的量与目标模板相同时，就会得到两条同等强度的产物，从而可以定量。这一方法的关键在于第一步，即如何构建好内参模板，既不能太大，也不能太小，既要能被扩增出来，又得与目标模板有同等的扩增效率；对此，本书提供了好几种解决方案。当然，即使不用竞争性PCR方法，我们依然能够作半定量分析，众所周知，在PCR反映的早期，产物是以指数形式倍增的，只要能提高检测手段的灵敏度，限制循环数，就能做半定量分析。而引入Western杂交、免疫荧光流式细胞仪分析、原位杂交加免疫组化则使这一技术变得更加容易。如果想要定量或者半定量的分析单个RNA在不同样本中的差异表达，逆转录PCR结合基因芯片技术无疑是最方便的，第十八章介绍了这方面的内容。除了检测不同发育阶段的基因表达外，逆转录PCR在癌症研究和诊断中还有很多应用；如逆转录PCR能检测到不同的肿瘤标志物相应mRNA，也能够检测到癌基因或抑癌基因的突变体，此外还能分析基因的多态性。鉴于从组织中提出的RNA的复杂性，单纯的RT-PCR技术并不能获得细胞中所有mRNA表达的情况，随着LCM技术的出现，这一难题迎刃而解。逆转录PCR的另一个优点在于它为研究RNA群体中的多样性提供了丰富的材料。例如第十三章给出了用逆转录PCR分析丙型肝炎病人血清中病毒RNA的多样性的方法。

构建 cDNA文库是一个复杂、多步骤的过程，每一步都存在信息的丢失，最后得到的重组克隆常常达不到构建一个代表性文库所需的量。而在克隆前先进行逆转录PCR，就能够构建出较大的cDNA文库。尤其是当初始细胞或者组织非常有限时，逆转录PCR就显得更有用了，已经有人从单个细胞中成功的建成了cDNA文库。

本书适用该领域的研究生和科研人员参考。

附：本书目次

第一部分：简介

第一章 逆转录 PCR(reverse-tranacriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)在生物医学中的应用：研究mRNA的新途径

著者： Joe O'Connell

第二章 RT-PCR操作注意事项

著者： Joe O'Connell

第二部分：高灵敏度检测分析 mRNA

第三章 用定量竞争 RT-PCR技术(quantitative Competitive RT-PCR)分析小块组织样本中微量mRNA

著者： Susanne Greber-Platzer, Brigitte Balcz, Christine Fleischmann, and Gert Lubec

第四章 检测单个细胞中的 mRNA表达和选择性剪切

著者： Tsutomu Kumazaki

第五章 嵌套式逆转录 PCR(nested RT-PCR)

著者： Triona Goode, Wen-Zhe Ho, Terry O'Connor, Sandra Busteed, Steven D.Douglas, Fergus Shanahan, and Joe O'Connell

第三部分：定量 RT-PCR

第六章 定量 RT-PCR常用方法综述

著者： Caroline Joyce

第七章 定量竞争 RT-PCR的快速发展

著者： Joe O'Connell, Aileen Houston, Raymond Kelly, Darren O'Brien, Aideen Ryan, Michael W.Bennett, and Kenneth Nally

第八章 RT-PCR--高效液相色谱分析联用技术

著者： Franz Bachmair, Christian G.Huber, and Guenter Daxenbichler

第九章 实时荧光分析 (Time-Resolved Fluorometry)--- RT-PCR联用技术

著者： Kaisa Nieminen, Markus Halminen, Matti Waris, Mika Makela, Johannes Savolainen, Minna Sjoroos, and Jorma llonen

第十章 mimic-based RT-PCR技术定量分析人单核吞噬细胞和淋巴细胞中的P蛋白表达

著者： Jian-Ping Lai, Steven D.Douglas, and Wen-Zhe Ho

第四部分： RNA病毒的检测分析

第十一章 检测并定量丙型肝炎病毒基因组

著者： Liam J.Fanning

第十二章 实时 RT-PCR半定量分析丙型肝炎病毒RNA

著者： Joerg f.Schlaak

第十三章 运用 RT-PCR分析丙型肝炎病毒的遗传异质性分布

著者： Brian Mullan, Liam J.Fanning, Fergus Shanahan, and Daniel G.Sullivan

第五部分：原位 RT-PCR

第十四章 原位免疫 PCR

著者： Yi Cao

第十五章 Laser-Capture Microdissecte RT-PCR

著者： Tatjana Crnogorac-Jurcevic, Torsten O.Nielsen, and Nick R.Lemoine

第十六章 克鲁氏症病例的 Laser-Capture Microdissecte RT-PCR分析

著者： Paul Ryan, Simon Aarons, Michael W.Bennett, Gary Lee, Gerald C.O'Sullivan, Joe O'Connell, and Fergus Shanahan

第十七章 RT-PCR制备原位杂交检测mRNA所用的探针

著者： Joe O'Connell

第六部分： mRNA差异表达分析

第十八章 RT-PCR-GENE CHIP联用技术

著者： Valentina I.Shustova and Stephen J.Meltzer

第十九章 RT-PCR半定量原发性肿瘤中的基因差异表达

著者： Benno Mann and Christoph Hanski

第七部分：遗传学分析

第二十章 用非同位素标记的核酸酶剪切分析检测单核甘酸多态性 (Single Nucle

otide Polymorphisms,SNP)

著者： Frank Waldron-Lynch, Claire Adams, Michael G.Molloy, and Fergal O'Gara

第八部分： RT-PCR在免疫学中的应用

第二十一章 运用 RT-PCR、单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)和核酸测序技术研究克隆增殖的T细胞

著者： Manae Suzuki Kurokawa, Kusuki Nishioka, and Tomohiro Kato

第二十二章 用肿瘤浸润的 B细胞构建一个噬菌体展示文库并获得scFv

著者： Nadege Gruel, Beatrix Kotian, Marie Beuzard, and Jean-Luc Teillaud

第二十三章 从 B细胞杂交瘤得到鼠源intrabody

著者： Chang Hoon Nam, Sandrine Moutel, and Jean-Luc Teillaud

第二十四章 FACS-RT-PCR联用技术定量分析细胞中的基因表达：白细胞亚型上的表面大麻受体的研究

著者： Jean Marchand and Pierre Carayon

第九部分： RT-PCR在反义技术中的应用

第二十五章 反义 RT-PCR技术的应用

著者： Michael C.Yeung and Allan S.Lau

第十部分： RT-PCR在cDNA克隆中的应用

第二十六章 RT-PCR在cDNA文库构建中的应用

著者： Vincent Healy

第二十七章 用于表达筛选的高通量 cDNA文库的构建

著者： Joe O'Connell

（武汉大学生命科学学院 博士研究生 姚远）